規(guī)范環(huán)境下色譜積分的合理合規(guī)性控制

為確保對(duì)色譜峰進(jìn)行正確的測(cè)量（或積分），需要分析人員對(duì)積分結(jié)果進(jìn)行準(zhǔn)確性和一致性判斷。在大多數(shù)情況下，人為參與的過(guò)程往往會(huì)導(dǎo)致判斷結(jié)果受到非客觀標(biāo)準(zhǔn)的影響。所以色譜積分的合理合規(guī)性尤為重要，這也是監(jiān)管機(jī)構(gòu)的審查重點(diǎn)，這篇文章我們將簡(jiǎn)要討論如何對(duì)色譜積分進(jìn)行合理合規(guī)性控制。

1 簡(jiǎn)介

高效液相色譜（HPLC）和氣相色譜（GC）是現(xiàn)代分析實(shí)驗(yàn)室中最常用的技術(shù)。這兩種技術(shù)的專(zhuān)屬性、靈敏度和靈活性使其適用于廣泛的樣品基質(zhì)中絕大多數(shù)被分析物的測(cè)定。這兩種技術(shù)的原始輸出都是信號(hào)強(qiáng)度對(duì)比時(shí)間的曲線圖，通常稱(chēng)為色譜圖。色譜圖中的各個(gè)峰分別對(duì)應(yīng)于樣品中的各個(gè)成分，而峰面積通常正比于樣品中相應(yīng)成分的濃度。

要定量樣品中的被分析物濃度，就需要對(duì)色譜圖進(jìn)行積分以測(cè)量峰的面積。現(xiàn)代高效液相色譜法和氣相色譜儀配備的電腦色譜數(shù)據(jù)采集和處理系統(tǒng)，都具備自動(dòng)化積分的功能，分析人員需要做的主要是設(shè)定適當(dāng)?shù)姆e分參數(shù)（例如：斜率靈敏度，噪聲閾值，峰寬閾值，峰面積的閾值，峰高閾值，撇去率等），軟件將依據(jù)這些參數(shù)來(lái)對(duì)各個(gè)色譜峰進(jìn)行確認(rèn)和積分。

2 監(jiān)管要求

由于分析人員可以根據(jù)自己的主觀判斷人為地設(shè)定積分參數(shù)，無(wú)論在常規(guī)審查或藥品生產(chǎn)上市授權(quán)評(píng)估過(guò)程中，對(duì)色譜峰正確和精確的積分及其過(guò)程都是重點(diǎn)審核內(nèi)容。

從美國(guó)FDA對(duì)藥企發(fā)布的警告信中，可以看到關(guān)于色譜積分的一些更加具體化的要求：

• 不允許采用手動(dòng)積分。

• 需要開(kāi)啟色譜軟件的審計(jì)跟蹤功能，并將包含積分參數(shù)的分析方法和原始數(shù)據(jù)一同保存，以確保方法的積分參數(shù)修改歷史可追溯。

• “更改積分參數(shù)，以得到好的積分結(jié)果”是不可接受的。在審查過(guò)程中，沒(méi)有合理解釋的多次重新積分被認(rèn)為是企圖人為操縱峰面積以獲得合格的結(jié)果。

• 方法一旦經(jīng)過(guò)驗(yàn)證且被用于藥品的常規(guī)QC放行，對(duì)后續(xù)每個(gè)色譜數(shù)據(jù)的積分都需要使用該方法以確保一致性。FDA當(dāng)前的期望實(shí)際上是傾向于將色譜方法“鎖定”以保證始終使用同樣的積分參數(shù)。

綜合來(lái)講，色譜峰的積分、積分參數(shù)的設(shè)定和驗(yàn)證、積分參數(shù)的修改和再驗(yàn)證等都要遵循科學(xué)合理的過(guò)程，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）或類(lèi)似的文件進(jìn)行控制。

3 控制色譜積分的合理合規(guī)性

那么，要怎樣控制色譜積分的合理合規(guī)性呢？我們分以下幾個(gè)小節(jié)來(lái)探討。

3.1 通用積分過(guò)程及參數(shù)

為了對(duì)積分參數(shù)進(jìn)行設(shè)定，有必要了解色譜數(shù)據(jù)處理程序是如何進(jìn)行積分的。這里將嘗試討論一個(gè)通用的過(guò)程，不同的色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)可能在細(xì)節(jié)上有所不同。

色譜積分過(guò)程包括下列事件：

  ? 確定初始基線

首先取第一數(shù)據(jù)點(diǎn)作為一個(gè)暫定基線點(diǎn)。然后積分器取一定數(shù)據(jù)點(diǎn)的平均值重新定義初始基線點(diǎn)。用作取平均值的數(shù)據(jù)點(diǎn)數(shù)是由峰寬函數(shù)決定的。在確立了的新的基線點(diǎn)前，第一數(shù)據(jù)點(diǎn)被取作初始基線點(diǎn)。

  ? 連續(xù)追蹤和更新基線

隨著積分器不斷錄入新的數(shù)據(jù)點(diǎn)，基線點(diǎn)需要向后推移并更新。被接納為基準(zhǔn)點(diǎn)，一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)必須符合以下條件：

  ? 它必須在所指定的由斜率閾值決定的基線閾值內(nèi)

  ? 基線的曲率必須低于由斜率閾值確定的閾值

  ? 累積總和不能超過(guò)指定的面積閾值

基線以由峰寬值決定的速率不斷重置，直到檢測(cè)出色譜峰。

  ? 色譜峰開(kāi)始時(shí)間的識(shí)別和確認(rèn)

當(dāng)新錄入的數(shù)據(jù)點(diǎn)超出基線閾值，并且基線曲率超過(guò)由斜率靈敏度函數(shù)確定的設(shè)定值，即辨別出一個(gè)潛在的色譜峰。如果接下來(lái)的數(shù)據(jù)點(diǎn)保持上升，并滿足下列條件，積分器即識(shí)別出一個(gè)潛在的色譜峰開(kāi)始時(shí)間。

  ? 斜率和曲率超過(guò)由基線閾值確定的限值

  ? 連續(xù)的數(shù)據(jù)點(diǎn)之間的差值超過(guò)噪聲閾值

潛在的色譜峰開(kāi)始時(shí)間被確認(rèn)的條件需要符合下列標(biāo)準(zhǔn)：

  ? 斜率繼續(xù)超過(guò)由基線閾值確定的限制

  ? 累計(jì)面積超出峰面積閾值

  ? 曲率變?yōu)樨?fù)值形成前拐點(diǎn)

  ? 色譜峰頂點(diǎn)的確認(rèn)

峰頂點(diǎn)的確認(rèn)需要滿足下列條件：

  ? 斜率通過(guò)零點(diǎn)并變?yōu)樨?fù)值

  ? 曲率變?yōu)檎?/span>

  ? 后續(xù)數(shù)據(jù)點(diǎn)的值降低，且該數(shù)據(jù)點(diǎn)與后續(xù)3個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)的峰面積差累計(jì)超過(guò)2/3的峰面積閾值。

  ? 色譜峰終點(diǎn)的識(shí)別和確認(rèn)

色譜峰潛在終點(diǎn)的識(shí)別條件：

  ? 斜率和曲率回落到由基線閾值確定的限值內(nèi)

  ? 兩個(gè)連續(xù)的數(shù)據(jù)點(diǎn)之間的差值小于5倍噪聲閾值

  ? 色譜峰終點(diǎn)的確認(rèn)條件：

  ? 斜率和曲率保持在基線閾值確定的限值內(nèi)

  ? 在方法建立過(guò)程中，依據(jù)不同參數(shù)對(duì)色譜積分事件的作用進(jìn)行各參數(shù)（斜率靈敏度，噪聲閾值，峰寬閾值，峰面積的閾值，峰高閾值等）的設(shè)定。

3.2 未完全分離色譜峰

對(duì)于色譜峰的最準(zhǔn)確的積分要求所有的峰完全分離。如有某些需要精確定量測(cè)定的峰沒(méi)有完全分離，首先需要優(yōu)化色譜分離條件。在經(jīng)過(guò)大量努力后還是不能獲得充分分離的情況下，可以考慮通過(guò)合理的積分獲取未分離組分相對(duì)的準(zhǔn)確峰面積。

如果定量數(shù)據(jù)必須從未分離峰獲得，需要制定明確的規(guī)定，以便確定未分離峰應(yīng)該如何積分。這樣的規(guī)定應(yīng)該包含在什么情況下可以使用什么功能對(duì)未分離色譜峰進(jìn)行積分，這些功能包括：

  ? 切線撇去

  ? 指數(shù)撇去

  ? 指數(shù)曲線擬合

  ? 直線撇去

  ? 前伸峰撇去

  ? 拖尾峰撇去

  ? 峰谷比

  ? 谷高比

  ? 谷垂直切分

3.3 積分效果的基本要求

進(jìn)行合理合規(guī)的積分需要明確怎樣才算是適當(dāng)和準(zhǔn)確的積分。筆者認(rèn)為原則性的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)該是“不多不少”地積分。

為使同一實(shí)驗(yàn)室內(nèi)不同分析人員有一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，建議在書(shū)面文檔中用圖表來(lái)說(shuō)明什么是可接受的色譜峰，什么是不可接受的色譜峰。如圖2，其中峰A表示可接受的積分峰；而峰B是不可接受的峰積分，因?yàn)榉宓耐衔膊糠治幢煌耆e入； 峰C也是不可接受的，因?yàn)閷⒖赡苁腔€漂移的區(qū)域積進(jìn)去了。

3.4 積分參數(shù)的設(shè)定和驗(yàn)證

在做主成分測(cè)定時(shí)，數(shù)據(jù)處理方法的控制相對(duì)容易。但是當(dāng)涉及到有關(guān)物質(zhì)測(cè)定時(shí)，數(shù)據(jù)處理方法的開(kāi)發(fā)和控制有時(shí)候是非常具有挑戰(zhàn)性的。建議在方法學(xué)的準(zhǔn)確度和精密度驗(yàn)證部分，專(zhuān)門(mén)考察改變積分參數(shù)對(duì)最終結(jié)果的影響。可以使用在回收率實(shí)驗(yàn)中獲得的原始數(shù)據(jù)，對(duì)下面的主要積分參數(shù)進(jìn)行系統(tǒng)化地測(cè)試（不同的數(shù)據(jù)處理軟件可能有不同的參數(shù)）：

• 斜率靈敏度

• 峰寬閾值

• 峰高閾值

• 面積閾值

• 噪聲閾值

記錄并評(píng)估這些參數(shù)的改變對(duì)回收率計(jì)算結(jié)果的影響，并在滿足回收率標(biāo)準(zhǔn)（通用標(biāo)準(zhǔn)為98.0~102.0%）的參數(shù)組合中選擇居中的參數(shù)組合，以便獲得更好的方法耐用性。后續(xù)出現(xiàn)分析結(jié)果異常（如出現(xiàn)新的未知雜質(zhì)）需要重新設(shè)定積分參數(shù)時(shí)，這些對(duì)參數(shù)改變的研究數(shù)據(jù)，也可以為參數(shù)的可修改范圍提供依據(jù)。

3.5 特殊情況下積分參數(shù)的重新設(shè)定和驗(yàn)證

分析人員有時(shí)候會(huì)遇到一些特殊情況。比如，一個(gè)通過(guò)驗(yàn)證的方法，在常規(guī)分析時(shí)完全沒(méi)有問(wèn)題，但在穩(wěn)定性測(cè)試期間，有時(shí)候后會(huì)有新的色譜峰、峰型改變、共洗脫峰等異常情況，這種情況下往往原來(lái)的分析方法不再適用。

如果是已上市藥品出現(xiàn)了上述異常情況，表示這些產(chǎn)品可能不符合規(guī)范，并應(yīng)啟動(dòng)實(shí)驗(yàn)室和生產(chǎn)調(diào)查，以表征雜質(zhì)，并確定其來(lái)源。這種情況一旦經(jīng)過(guò)確認(rèn)，企業(yè)需要從市場(chǎng)上召回產(chǎn)品，因?yàn)橐粋€(gè)產(chǎn)品降解特性的鑒定是銷(xiāo)售許可的先決條件。

在另一方面，如果異常情況出現(xiàn)在產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的早期階段，同樣需要表征雜質(zhì)和確定其來(lái)源。這時(shí)候分析人員可能需要修改數(shù)據(jù)處理方法或者整個(gè)分析方法并重新驗(yàn)證。這種情況在藥物研發(fā)的早期階段經(jīng)常發(fā)生，可以說(shuō)分析方法驗(yàn)證應(yīng)被視為一個(gè)過(guò)程，而非一次性的工作。

4 結(jié)論意見(jiàn)

色譜峰的積分是在現(xiàn)代分析實(shí)驗(yàn)室中最經(jīng)常執(zhí)行的活動(dòng)之一。為了獲得一致的結(jié)果，每次分析數(shù)據(jù)的積分都需要使用相同的方式。正是出于這個(gè)原因，我們建議實(shí)驗(yàn)室建立適當(dāng)?shù)囊?guī)范和標(biāo)準(zhǔn)操作程序，為準(zhǔn)確和科學(xué)的積分提供明確的依據(jù)。

此外，應(yīng)該建立明確的程序，規(guī)范方法開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證階段的積分參數(shù)選擇和驗(yàn)證。而經(jīng)核準(zhǔn)的書(shū)面方法應(yīng)該包括合適的色譜積分參數(shù)，并指定允許分析人員在必要的異常情況下作出適當(dāng)調(diào)整的范圍。一個(gè)方法一旦經(jīng)過(guò)驗(yàn)證且被使用，之后對(duì)每個(gè)色譜數(shù)據(jù)的積分都需要用這個(gè)方法以確保使用相同的參數(shù)。而出現(xiàn)異常情況對(duì)方法做出調(diào)整后，需要重新驗(yàn)證并對(duì)異常事件根源進(jìn)行調(diào)查和合理的解釋。